El análisis proteómico se basa principalmente en las técnicas de separación de proteínas mediante métodos eletroforéticos y cromatográficos, preparación de las muestras para su análisis y finalmente el análisis e identificación de las proteínas por espectrometría de masas (EM).

Separacion

El método de separación de proteínas más utilizado en las últimas décadas ha sido la electroforesis bidimensional. Esta metodología permite el análisis de muestras proteícas complejas, debido a su capacidad de aislar cientos de proteínas en un sólo gel. Se fundamenta en la combinación ortogonal de dos técnicas electroforéticas, la separación de proteínas por su punto isoeléctrico (isoelectroenfoque) y la separación por su peso molecular (SDS-PAGE).Sin embargo, en los últimos años, la cromatografía líquida en sus diferentes modalidades está ganando terreno, debido a la introducción de la cromatografía líquida de fase reversa capilar con nano flujo acoplada a los espectrómetros de masas. Este desarrollo tecnológico fué realizado por Donald Hunt y es la pieza fundamental en los sistemas LC-MS (Liquid Chromatography - Mass Spectrometry). Posteriormente, John Yates Jr (Scripps Institute) acopló la cromatografía líquida multidimensional (MudPit) a los espectrómetros de masa tipo electrospray(ESI). Esta tecnología se fundamenta en la asociación de dos fases, una de separación por intercambio iónico y otra por interacción hidrofóbica, logrando así el aislamiento péptidos(producidos a través de digestión enzimática) en mezclas complejas de una o de miles de proteínas. Por último, durante la Jornada proteómica IBT-CCG organizada por la SMP en octubre del 2005, la Dra. Elizabeth Want, divulgó una nueva versión de la cromatografía líquida multidimensional acoplada a sistemas ESI utilizando tres fases cromatográficas en tandem. Constituidas de una primera fase hidrofóbica FR-C18 acoplada a una columna de intercambio iónico y, finalmente, otra columna de una fase reversa C18. Esta metodología se desarrolló en el laboratorio del Dr. Gary Syusdak (Scripps Institute). La optimización de estos sistemas requiere experiencia, ya que las fugas generadas por la alta presión, la sincronía de las diferentes fases móviles y el mantenimiento de flujo constante son las desventajas de estos sistemas.

Procesamiento de muestras

La preparación de las muestras para el análisis por espectrometría de masas sin duda, es el paso más importante para la obtención de buenos resultados. En general, las proteínas separadas por los métodos descritos anteriormente, son digeridas con enzimas proteolíticas. Se utiliza principalmente la tripsina por algunas razones obvias: su especificidad (N-term R y K, excepto cuando son seguidas de P), la distribución promedio de K y R cada 20 residuos de amino ácidos en las secuencias proteícas y, para diferenciar lisinas de glutaminas, amino ácidos que presentan isomasas de 128 a.m.u. La digestión de proteínas separadas por electroforesis en geles es realizada "in gel". Este proceso involucra el corte de la prote“na de ínteres, el desteñimiento del pedacito de gel, la reducción de los puentes de disulfuro, alquilación de las cisteinas, extracción de los péptidos trípticos y limpieza (desalado) de la muestra por puntas con fase reversa. En estos procesos la contaminación de las muestras por queratina humana es un problema, ya que algunos de los péptidos generados por este tipo de contaminación se ionizan fácilmente y suprimen la intensidad de los picos de interés, especialmente cuando se trabaja con bajas concentraciones proteicas. Algo similar ocurre debido al uso de concentraciones excesivas de tripsina, utilizada para disminuir los tiempos de incubación. Para evitar este tipo de contaminación se recomienda trabajar en mesas limpias, sin corriente de aire, protección para el cabello y guantes desechables. La concentración de tripsina recomendable, según varios protocolos y por experiencia personal es de 20 ug/ml. Las señales m/z producidas por estos tipos de contaminación, cuando son de baja intensidad, son muy útiles ya que se utilizan como patrones internos de calibración en los análisis de PMFP (peptide mass finger print) por MALDI-TOF. En el caso de laboratorios que poseen digestores automáticos de proteínas, la posibilidad de contaminación por queratina se disminuye parcialmente, pero no se elimina.

La digestión enzimática de proteínas para su posterior análisis por espectrometría de masas, es uno de los procesos bioquímicos utilizados en el área de la proteómica. Para la determinación de modificaciones postraduccionales, las cuáles se presentan de manera frecuente en las proteínas se utiliza una gran variedad de reacciones y metodologías bioquímicas para modificar y/o aislar un determinado péptido de interés, como por ejemplo el aislamiento de péptidos fosforilados a través de columnas IMAC, deglicolisación de N-glicosídios con PNGsa y marcación con O18, entre otras. La cuantificación de la expresión diferencial de proteínas en sistemas biológicos basado en las tecnologías i-TRAQ, ICAT y SCAPE requieren modificaciones específicas de los péptidos trípticos, las cuales involucran una serie de procesos químicos que permitan un análisis diferencial en los espectrómetros de masas. El bloqueo del N-terminal de péptidos trípticos con grupos con carga negativa (sulfonación) para favorecer la fragmentación (supresión de serie iónica) en los diferentes analizadores iónicos es una técnica muy utilizada para favorecer la interpretación de los espectros CID (Collision-Induced Dissociation) y PSD (Post-Source Decay). Las metodologías que aquí describo representan sólo algunos ejemplos de los cientos de modificaciones específicas de péptidos que existen en la literatura. Por tanto, la preparación adecuada de las muestras para su análisis y la correcta elección de la modificación o captura de los péptidos de interés son factores cruciales en el análisis proteómico.

Espectrometria de Masas

Los espectrómetros de masas trabajan aplicando fuerzas electro-magnéticas sobre partículas cargadas en el vacío. Por ello, el análisis de proteínas o péptidos por espectrometría de masas requiere inicialmente un sistema de ionización capaz de producir mega-iones y mantenerlos disueltos a nivel molecular en fase gaseosa. La generación de iones en fase gaseosa a partir de macromoléculas fue un gran desafío, sin embargo a finales de los 80 se desarrollaron dos nuevas técnicas de ionización que cambiaron el rumbo del análisis de proteínas. Estos fueron los sistemas de ionización MALDI Y ESI. El sistema MALDI (Matriz Assisted Lazer Desortion/Ionization) se basa en que el analito es atrapado en una red de cristales producidos por matrices sólidas y la desabsorción e ionización del analito a través de rápidos pulsos de láser. Las matrices son, en general, ácidos orgánicos de bajo peso molecular que tienen como propiedad fundamental una gran capacidad de absorción de la energía ultra-violeta. La sublimación del sistema analito/matriz permite la ionización de ambos y la introducción de los mismos en los analizadores iónicos. El método de ionización ESI (Electrospray Ionization) consiste en la liberación del analito en forma líquida a través de una aguja sometida a alto voltaje. El alto voltaje supera la tensión superficial del solvente produciendo un chorro de micro-gotas. Las micro-gotas, sujetas a la evaporación reducen su diámetro hasta llegar al límite de Rayleigh, lo que provocará sucesivas explosiones Coulombicas llevando a la liberación del analito a su disolución a nivel molecular en fase gaseosa. Recientemente, Graham Cooks reportó un revolucionario método de ionización denominado DESI (Desorption Electrospray Ionization) que es un híbrido de los dos métodos descritos previamente, el cual puede desabsorber el analito de fuentes naturales in vivo. Básicamente se incide el chorro del ESI (mezclas de solventes orgánicos disueltos en agua) sobre la superficie que contiene el analito. El analito ionizado será introducido al sistema óptico del equipo a través de un conducto en vacío que conducirá los iones hacia el analizador iónico. Uno de los analizadores iónicos más utilizados es el Tiempo de Vuelo (Time of Flight-ToF), generalmente acoplados a los sistemas de ionización tipo MALDI, en el cual los iones son diferenciados por los valores de la relación m/z que son proporcionales a su tiempo de vuelo específico en tubos sobre vacío. Los detectores por Tiempo de vuelo presentan gran resolución y exactitud. Sin embargo, una de sus grandes desventajas es la necesidad de calibración constante durante los análisis. Los analizadores tipo trampa de iones (Ion Trap) actualmente se dividen en tres: la trampa de iones tri-dimensional o Trampa de Paul (referiendose a su creador Wolfgang Paul), las trampas lineales y las trampas de iones asociadas a la resonancia ciclotrónica de iones con transformada de Fourier (FT-ICR). Básicamente, son compuestos de varios electrodos que producen un campo electro-magnético donde se quedan atrapados los iones hasta su liberación a través de un barrido ascendente de longitud de onda electromagnética. Su liberación obedece a la relación m/z, donde los más ligeros salen primero y consecutivamente salen los más pesados. Los analizadores tipo triplo-cuadrupolo están constituidos por cuadrupolos o octapoles construidos con barras de metal en forma circular capaces de producir campos electromagnéticos. Los cuadrupolos son acoplados en forma lineal lo que permite la manipulación de los iones en diferentes espacios, por eso conocidos como analizadores "tandem in space". Sin embargo, los espectrómetros más modernos, con mayor resolución, sensibilidad y exactitud son formas híbridas entre sistemas de ionización y analizadores iónicos: Q-ToF, TriploQuad con trampa lineal, trampas lineales acoplados a FT-ICR, trampas lineales acopladas a Orbit Traps, MALDI-ToF/ToF, entre otros.

Una de las características tecnológicas más apreciada de estos equipos es la capacidad de producir fragmentaciones ordenadas de péptidos. Estas fragmentaciones, conocidas como MS/MS, MSn, CAD o CID, son producidas por un incremento de energía en las cámaras de fragmentación auxiliadas por un gas neutro, helio o argon. Los espectros CID permiten secuenciar péptidos de 200 Da hasta 4 kDa a través de la interpretación de las series iónicas (a, b, c y x, y, z) producidas por la fragmentación. Además, estos tipos de fragmentación son excelentes para identificación y determinación de los sitios de modificaciones post-traduccionales. El análisis proteómico basado en la espectrometría de masas es el método de elección para la identificación, caracterización y secuenciación de proteínas por su rapidez, exactitud y versatilidad. Sin embargo, su limitación es el costo de los equipos híbridos, de mayor potencial analítico, que varia entre 500,000.00 hasta un millón de dólares americanos.